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一种用于快速诊断与鉴别诊断BHD综合征的目标基因捕获测序方法及应用
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挂牌 挂牌开始时间: 2021-11-02 剩余时间:20月
商品编号
44906193045268551062
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技术转让
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南京大学苏州高新院
电话 139xxxx1710
本发明公开了一种用于快速诊断与鉴别诊断BHD综合征的目标基因捕获测序方法及应用。本发明的一个基因panel在制备用于诊断与鉴别诊断BHD综合征的试剂盒的用途,所述基因panel包含四个基因:FLCN、SERPINA1、TSC1、TSC2。所述的基因panel,富集捕获的基因区域包括:FLCN全基因序列;SERPINA1、TSC1、TSC2三个基因的外显子及外显子-内含子交界50bp的区域。通过设计引物,进行长片段多重PCR反应富集目标区域序列进行二代测序,可以检出各种类型的突变形式,有效诊断和鉴别诊断BHD。本发明的方法降低检测成本,并提高检测的灵活性与效率。
<p style="margin-right:7px;text-indent:0;line-height:150%"><strong><span style="font-family:宋体">技术领域</span></strong></p><p style="margin-top:21px;text-align:left;text-indent:32px;line-height: 150%"><span style="font-size:16px;line-height:150%;font-family:宋体">本发明属于生物技术和诊断学领域,具体涉及用于快速诊断与鉴别诊断<span>BHD</span>综合征的目标基因捕获测序方法及应用。</span></p><p style="margin-top:21px;text-align:left;line-height:150%"><strong><span style="font-size:16px;line-height:150%;font-family:宋体">背景技术</span></strong></p><p style="margin-top:21px;text-align:left;text-indent:32px;line-height: 150%"><span style="font-size:16px;line-height:150%;font-family:宋体">原发性自发性气胸(<span>PSP</span>)是指在无明显外伤及基础疾病的情况下发生的气体进入负压胸膜腔,造成肺压缩的病理状态,气体进入患者的胸膜腔,造成肺不张和低氧血症,重者可发生呼吸困难,危及生命。病理上多认为由胸膜下肺大疱破损引起。约有<span>11.5%</span>的<span>PSP</span>患者被报道有家族史,说明这些患者气胸的发生与遗传相关。部分家族性<span>PSP</span>可归因为某些基因遗传突变,如<em><span>FBN1, COL3A1, CBS, SERPINA1</span></em>和<em><span>TSC1/TSC2</span></em>等引起的特定遗传性单基因疾病,这些基因突变导致的综合征多不以气胸为首先出现的表型,肺外表型明显,易于鉴别。相当一部分<span>PSP</span>病人(约<span>10%</span>)是由<em><span>FLCN</span></em>基因遗传性杂合突变引起,该基因杂合突变可导致以皮损、肺大泡<span>/</span>气胸及肾癌为特征的<span>BHD</span>综合征(<span>BHD, OMIM #135150</span>)<span>,</span>临床上需要与其他<span>PSP</span>进行鉴别诊断。</span></p><p style="margin-top:21px;text-indent:32px;line-height:150%"><span><span style="font-size:16px;line-height:150%">近几年在气胸人群中的研究表明,<span>FLCN </span>突变的患者可仅有肺大疱或<span>PSP </span>表型,而皮肤和肾脏的表型晚发或缺失,与其他<span> PSP </span>难以辨别,加之临床缺乏适宜的筛查手段,常造成广泛的混诊或误诊,并被当作单纯<span> PSP </span>进行治疗。由于<span> FLCN </span>基因突变携带者及其一级亲属患肾癌的风险较正常人高<span> 9.3 </span>倍,定期随访检查,准确及时发现这些患者,早期诊断、预防和治疗肾癌,成为改善该病预后的关键。所以,从<span> PSP </span>患者中诊断出<span> BHD </span>综合征是一个迫切需要。在我国相关研究和临床诊断及鉴别诊断尚未广泛开展。</span></span></p><p style="margin-top:21px;text-align:left;text-indent:32px;line-height: 150%"><span style="font-size:16px;line-height:150%;font-family:宋体;color:black">目前为止, </span><span style="font-size:16px;line-height:150%;font-family: &#39;TimesNewRomanPSMT&#39;,&#39;serif&#39;;color:black">BHD </span><span style="font-size: 16px;line-height:150%;font-family:宋体;color:black">综合征的分子诊断主要依赖于 </span><span style="font-size:16px;line-height:150%;font-family:&#39;TimesNewRomanPSMT&#39;,&#39;serif&#39;;color:black">Sanger </span><span style="font-size:16px;line-height:150%;font-family:宋体;color:black">测序,而 </span><span style="font-size:16px;line-height:150%;font-family:&#39;TimesNewRomanPSMT&#39;,&#39;serif&#39;;color:black">BHD </span><span style="font-size:16px;line-height:150%;font-family:宋体;color:black">综合征的致病基因 </span><em><span style="font-size:16px;line-height:150%;font-family:&#39;TimesNewRomanPS-ItalicMT&#39;,&#39;serif&#39;;color:black">FLCN </span></em><span style="font-size:16px;line-height:150%;font-family:宋体;color:black">目前已被报道有多种突变形式,包括点突变、小插入</span><span style="font-size:16px;line-height:150%;font-family:&#39;TimesNewRomanPSMT&#39;,&#39;serif&#39;;color:black">/</span><span style="font-size:16px;line-height:150%;font-family: 宋体;color:black">缺失以及片段缺失或重复,前两种突变可以使用 </span><span style="font-size: 16px;line-height:150%;font-family:&#39;TimesNewRomanPSMT&#39;,&#39;serif&#39;;color:black">Sanger </span><span style="font-size:16px;line-height:150%;font-family:宋体;color:black">测序检测到,而片段缺失或重复则需要另外使用 </span><span style="font-size: 16px;line-height:150%;font-family:&#39;TimesNewRomanPSMT&#39;,&#39;serif&#39;;color:black">MLPA </span><span style="font-size:16px;line-height:150%;font-family:宋体;color:black">等技术来检测,这就增加了基因诊断的工作量和复杂性。此外,由于</span><em><span style="font-size:16px;line-height:150%;font-family:&#39;TimesNewRomanPS-ItalicMT&#39;,&#39;serif&#39;;color:black">SERPINA1</span></em><span style="font-size:16px;line-height:150%;font-family:宋体;color:black">和</span><em><span style="font-size:16px;line-height:150%;font-family:&#39;TimesNewRomanPS-ItalicMT&#39;,&#39;serif&#39;;color:black">TSC1</span></em><span style="font-size:16px;line-height:150%;font-family:&#39;TimesNewRomanPSMT&#39;,&#39;serif&#39;;color:black">/</span><em><span style="font-size:16px;line-height: 150%;font-family:&#39;TimesNewRomanPS-ItalicMT&#39;,&#39;serif&#39;;color:black">TSC2 </span></em><span style="font-size:16px;line-height:150%;font-family:宋体;color:black">基因突变也会引起</span><span style="font-size:16px;line-height:150%;font-family:&#39;TimesNewRomanPSMT&#39;,&#39;serif&#39;;color:black">PSP</span><span style="font-size:16px;line-height:150%;font-family:宋体;color:black">,</span><em><span style="font-size:16px;line-height:150%;font-family:&#39;TimesNewRomanPS-ItalicMT&#39;,&#39;serif&#39;;color:black">TSC1</span></em><span style="font-size:16px;line-height:150%;font-family:&#39;TimesNewRomanPSMT&#39;,&#39;serif&#39;;color:black">/</span><em><span style="font-size:16px;line-height: 150%;font-family:&#39;TimesNewRomanPS-ItalicMT&#39;,&#39;serif&#39;;color:black">TSC</span></em><span style="font-size:16px;line-height:150%;font-family:宋体;color:black">突变的患者同样也会有肾癌表现,临床上与<span>BHD</span>较难鉴别,所以在进行<span>BHD</span>的诊断和鉴别诊断时,这些基因也应该列入</span><span style="font-size:16px;line-height:150%;font-family:&#39;TimesNewRomanPSMT&#39;,&#39;serif&#39;;color:black">PSP</span><span style="font-size:16px;line-height:150%;font-family:宋体;color:black">患者的筛查范围。这样每个需要筛查的患者就需要设计</span><span style="font-size:16px;line-height:150%;font-family:&#39;TimesNewRomanPSMT&#39;,&#39;serif&#39;;color:black">86</span><span style="font-size:16px;line-height:150%;font-family:宋体;color:black">对引物,做</span><span style="font-size:16px;line-height:150%;font-family:&#39;TimesNewRomanPSMT&#39;,&#39;serif&#39;;color:black">86</span><span style="font-size:16px;line-height:150%;font-family:宋体;color:black">个</span><span style="font-size:16px;line-height:150%;font-family:&#39;TimesNewRomanPSMT&#39;,&#39;serif&#39;;color:black">PCR</span><span style="font-size:16px;line-height:150%;font-family:宋体;color:black">和一代测序反应,以及至少</span><span style="font-size:16px;line-height:150%;font-family:&#39;TimesNewRomanPSMT&#39;,&#39;serif&#39;;color:black">4</span><span style="font-size:16px;line-height:150%;font-family: 宋体;color:black">组</span><span style="font-size:16px;line-height: 150%;font-family:&#39;TimesNewRomanPSMT&#39;,&#39;serif&#39;;color:black">MLPA</span><span style="font-size:16px;line-height:150%;font-family:宋体;color:black">探针反应,这些因素使得整个基因诊断流程相对复杂,成本高、效率低且工作量大, 导致这种基于传统技术基础的诊断体系很难满足目前临床筛查的需求</span><span style="font-size:16px;line-height: 150%;font-family:宋体">。因此,需要一种有效、经济、易操作且准确的技术对整个<span>BHD-PSP </span>疑似群体进行筛查。</span></p><p style="margin-top:21px;text-align:left;text-indent:32px;line-height: 150%"><span style="font-size:16px;line-height:150%;font-family:宋体;color:black">随着近几年下一代测序技术的发展, 目前已建立全基因组测序和目标序列捕获测序等捕获方法,使用目标序列捕获方法,我们能够将目标基因或基因组区域特异性捕获下来进行高通量二代测序, 其一次实验就可以同时对几百人甚至几千人的目标基因进行测序, 目前已经被成功应用于一些基因异质性疾病如乳腺癌及先天性肌萎缩等的临床筛查研究。</span></p><p style="margin-top:21px;text-align:left;text-indent:32px;line-height: 150%"><span style="font-size:16px;line-height:150%;font-family:宋体">综上所述,临床<span>PSP </span>群体中有约<span>10%</span>是<span>BHD-SPS</span>,这一部分人群具有肾癌的高风险,且其一级亲属也存在相似风险,必须早期鉴别诊断,以利于肾癌的早期识别和防治。而现有基因诊断技术相对复杂,若在临床推广具有成本高却收益低、操作相对复杂且耗时长等不足。因此,可以利用下一代测序技术,将<span>FLCN</span>及需要与<span>BHD</span>鉴别诊断的基因富集下来进行二代测序,以<span style="color:black">期建立一个不仅能检测</span></span><span style="font-size: 16px;line-height:150%;font-family:&#39;TimesNewRomanPSMT&#39;,&#39;serif&#39;;color:black">SNV</span><span style="font-size:16px;line-height:150%;font-family:宋体;color:black">、小插入</span><span style="font-size:16px;line-height:150%;font-family:&#39;TimesNewRomanPSMT&#39;,&#39;serif&#39;;color:black">/</span><span style="font-size:16px;line-height:150%;font-family: 宋体;color:black">缺失的突变,同时也能检测基因内片段缺失或重复的基因筛查方法。该方法使用更少的模板 </span><span style="font-size:16px;line-height:150%;font-family:&#39;TimesNewRomanPSMT&#39;,&#39;serif&#39;;color:black">DNA</span><span style="font-size:16px;line-height:150%;font-family:宋体;color:black">,却能够更快更高效地得到人群中的突变信息,且成本更低,适合应用于临床筛查诊断。</span></p><p style="margin-top:21px;text-align:left;line-height:150%"><strong><span style="font-size:16px;line-height:150%;font-family:宋体">发明内容</span></strong></p><p style="margin-top:21px;text-align:left;line-height:150%"><span style="font-size:16px;line-height:150%;font-family:宋体">本发明的目的是提供用于快速诊断与鉴别诊断<span>BHD</span>综合征的目标序列捕获测序方法,完成并规范化从目标序列富集的引物设计到下机后数据分析的一系列流程,并以此为基础制备可进行临床推广的用于快速诊断与鉴别诊断<span>BHD</span>综合征的试剂盒。</span></p><p style="margin-top:21px;text-align:left;text-indent:32px;line-height: 150%"><span style="font-size:16px;line-height:150%;font-family:宋体">为达到上述目的,本发明采用的技术方案如下:从建好的组织样本库中选择<span>BHD-PSP</span>(验证组)和随机挑选的<span>PSP</span>样本(发现组),在这些样本中进行目标区域的富集并测序,在验证组中评估该方法同时检测<span>SNV</span>、小插入<span>/</span>缺失和基因内片段缺失的能力及效率(假阴性率);在发现组中评估该方法检测的假阳性率。综合评估该方法用于<span>BHD</span>诊断与鉴别诊断的准确性,完成并规范化从目标序列富集的引物设计到下机后数据分析的一系列流程。进一步的,以此为基础制备可进行临床推广的用于快速诊断与鉴别诊断<span>BHD</span>综合征的试剂盒。</span></p><p style="margin-top:21px;text-align:left;line-height:150%"><strong><span style="font-size:16px;line-height:150%;font-family:宋体">本发明有益效果:</span></strong></p><p style="margin-top:21px;text-align:left;line-height:150%"><span style="font-size:16px;line-height:150%;font-family:宋体">1. </span><span style="font-size:16px;line-height:150%;font-family:宋体">本发明评估并验证了目标序列捕获测序法作为<span>BHD</span>临床筛查性基因诊断的有效性及可行性。结果显示所有已知突变都能够被准确检出,假阴性率为<span>0</span>。<span style="color:black">本发明提出了一个新的在</span></span><span style="font-size:16px;line-height:150%;font-family:&#39;TimesNewRomanPSMT&#39;,&#39;serif&#39;;color:black">PSP</span><span style="font-size:16px;line-height:150%;font-family:宋体;color:black">人群中筛查诊断和鉴别诊断</span><span style="font-size:16px;line-height:150%;font-family:&#39;TimesNewRomanPSMT&#39;,&#39;serif&#39;;color:black">BHD</span><span style="font-size:16px;line-height:150%;font-family:宋体;color:black">综合征患者的方法,该方法由于其快速、高通量及花费较少的优点,加上可以在一次实验中检测到 </span><span style="font-size:16px;line-height:150%;font-family:&#39;TimesNewRomanPSMT&#39;,&#39;serif&#39;;color:black">Sanger </span><span style="font-size:16px;line-height:150%;font-family:宋体;color:black">测序无法同时检测的多种突变形式,更加适用于在大样本量的人群中做突变筛查,可以代替一代测序和</span><span style="font-size:16px;line-height:150%;font-family:&#39;TimesNewRomanPSMT&#39;,&#39;serif&#39;;color:black">MLPA</span><span style="font-size:16px;line-height:150%;font-family:宋体;color:black">在临床实验室推广应用。</span></p><p style="margin-top:21px;text-align:left;line-height:150%"><span style="font-size:16px;line-height:150%;font-family:宋体;color:black">2. </span><span style="font-size: 16px;line-height:150%;font-family:宋体;color:black">本发明同时改进了<span>CNV</span>分析的方法,不仅能够检出片段缺失,同时可以检出其大致断点,并提高<span>CNV</span>检测结果的准确性。</span></p><p style="margin-top:21px;text-align:left;line-height:150%"><span style="font-size:16px;line-height:150%;font-family:宋体;color:black">3. </span><span style="font-size: 16px;line-height:150%;font-family:宋体;color:black">本发明使用长片段扩增的富集方法,可以自行设计引物进行目标区域的捕获,同订购商业化捕获探针相比,可降低成本并提高灵活性与效率。</span></p><p style="line-height:150%"><strong><span style="font-size:16px;line-height:150%;font-family:黑体">&nbsp;</span></strong></p><p><br/></p>
商品类型 技术成果 项目阶段 研制
知识产权 专利号 成果权属 共有
技术领域 新型电生理检测和监护技术 交易方式 技术转让 有效期至 2025-12-31
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